微生物检查中的观察与定量分析方法

微生物检查的主要目的
微生物的主要观察方法
借助荧光显微镜的微生物观察与定量分析

微生物检查的主要目的

微生物检查的目的大致分为，关系到食品及化妆品等产品的卫生方面或安全方面等的检查，以及与传染病相关的医疗性检查。
在此，对直接摄入体内的食品微生物检查的目的进行说明。

食品微生物检查及其目的

食品微生物检查是指食品企业基于食品安全管理的目的，为确认是否存在引起食物中毒的微生物（细菌）及卫生状态而调查细菌数量。
食品企业必须遵照微生物（细菌）检查标准进行检查，在原材料采购、制造、运输、保管等整个食品链确保并确认食品安全性。
为防止出现问题，在生产产品时实施卫生管理或品质、安全性评价。此外，在产品出货后收到消费者投诉时或发生了可能是由所生产的食品引起的食物中毒时，为查明原因，必须对剩余食品或材料、用于生♛产的烹饪器具、设备、设施内部清洁等进行检查，并采取防再发对策。

微生物的主要观察方法

在食品或化妆品中需要检查的大部分微生物、细菌均为无色透明。因此，微生物的观察、辨识、判断及评价需要采用符合透明样品的观察及分析方法。在此对使用光学及染♑色的典型微生物观察及分析方法进行说明。

微分干涉观察（DIC）

何谓微分干涉观察（DIC）

微分干涉观察（DIC：Differential Interference Contrast）是利用光程差观察无色透明样品的方法。例如，光线透过透明微生物样品时，由于该样品的不同部位具有的厚度及折射率上的差异，透射光的前进距离（光程）长度也随之变化。这就是光程差。对样品的厚度梯度附加对比度，可获得具有立体感的图像。另外，阴影附加方法（对比度）具有方向性，对此进行微调后也可进行观察。

微分干涉观察的构成与原理

具备微分干涉观察功能的显微镜在聚光透镜上与物镜上均配备有微分干涉棱镜（DIC棱镜）。另外，在聚光透镜上配备了起偏振镜，物镜上配备了分析器，这些偏光板分别配置于DIC棱镜外侧。由光源发射的光透过起偏振镜后，成为朝同一方向振动的“偏光”。偏光经由电容器上的DIC棱镜，分成振动的2条偏光，以几乎平行的方向照射样品。此时，透过样品的较厚部位的偏光与透过较薄部位的偏光存在光程差异（光程差）。透过样品的2条偏光在物镜上的DIC棱镜中汇合，并透过分析器。可将2条偏光的光程差引起的干涉作为明暗对比度进行观察。

微分干涉观察的注意点

塑料容器在受光时容器自身会发生偏光，因此微分干涉观察中必须使用玻璃容器。另外，样品或镜头污渍也因附加对比度而显示为干扰，因此在观察前必须清除污渍。而且，观察图像的阴影附加方法（对比度）具有方向性，因此需要将样品与载物台一起旋转，从而改变对比度的方向性来进行观察。

相位差观察

何谓相位差观察

相位差观察是利用光源发射光通过样品时的衍射光*与直射光间相位偏离的观察方法。将此相位偏离（光程差）转换为明暗对比度，即可观察未染色的微生物等透明样品。

相位差观察的构成与原理

具有相位差观察功能的显微镜在光程上配置有相位板（相差板）与环缝（环状光阑）。利用环缝使光源发射光变成环状。环状光经由聚光透镜或样品，通过物镜上的环状相位板。此时相位板使通过样品后的光相位发生偏离。
在此光程上配置样品时，由于光通过样品时的折射*，将分成直射光与衍射光*的2条光线。相位不同的光经由物镜通过相位板时，因波长干扰而发生增强或衰弱。在相位差观察中，将这些相位差干扰作为物体图像与背景的明暗对比进行可视化，以便于观察。

* 光折射（衍射光）：由于光具有波，光程上存在障碍物（样品）时，一部分光将不直射而折射进入障碍物的现象，将此类光称为衍射光。

相位差观察的注意点

环缝中心调整不准确时，环缝光会从相位板泄漏，直射光的相位变化会变弱，对比度也随之变小。另外，因样品原因造成标本状态不同时，每次更换样品都要调整环缝中心。

革兰氏染色

何谓革兰氏染色

革兰氏染色是用于判断、辨识无色透明微生物或细菌的一种染色法。不同于微分干涉观察（DIC）或相位差观察等光学方式，通过使用试剂对无色透明样品进行染色或脱色，按细菌的细胞壁构造或成分区分染色，据其颜色或形状进行分析或判断。

革兰氏染色（食品微生物检查）的步骤示例

典型的革兰氏染色包括简单染色法、鉴别染色法、负染色法共3种。下面使用被视为标准的简单染色法的食品微生物检查为例，说明革兰氏染色步骤。

涂抹: 在经过脱脂后施加灭菌精制水的载玻片上涂抹纯培养菌。经过自然干燥后，使载玻片的背面通过小火焰（火焰固定）。从载玻片背面进行清洗（水洗）。其他固定方法有干燥后浸入甲醇的酒精固定。

染色: 在载玻片上用水晶紫罗兰液（结晶紫溶液）染色并清洗，然后卢戈氏液染色后再次清洗。

脱色: 使用95％乙醇（或丙酮醇）进行脱色。仔细清洗双面以防止涂抹面有乙醇或酒精等残留。

后染色和干燥: 使用番红染色液（或Pfeiffer液）进行后染色后，再次清洗。擦拭附着于标本上的水，用滤纸清除水分后，通过自然干燥进行充分干燥。

显微镜检查: 使用油浸镜头，进行高倍率显微镜检查。

基于染色性或形状、形态等的微生物判断

下面介绍基于革兰氏染色的染色性或形状进行分类，或推测及判断微生物、细菌等属性的示例。

	微生物、细菌	属性推测、判断示例
染色性	革兰氏阳性菌	蓝色染色（细胞壁较厚，难以脱色）。
染色性	革兰氏阴性菌	红色染色（细胞壁较薄，易于脱色）。
形状、形态等	革兰氏阳性球菌	葡萄穗状的葡萄球菌（Staphylococcus属）或链状的链球菌（Streptococcus属）等。食物中毒的病原菌有金黄色葡萄球菌等。
	革兰氏阳性杆菌	呈松叶状或栅状、V字状、W字状等形状排列的胆碱属（Corynebacterium属）或呈粗方形或梯形的芽孢杆菌属（Bacillus属）等。食物中毒的病原菌有魏氏杆菌、蜡状芽孢杆菌、肉毒杆菌等。
	革兰氏阴性球菌	多数情况下，从咯痰等检测形态判断引起传染病的细菌。
	革兰氏阴性杆菌	粗状细菌的两端被染成深色，代表性的有相比于其他革兰氏阴性杆菌更大的肠道细菌（大肠杆菌等）或呈细小状的葡萄糖非发酵菌（绿脓菌等）。食物中毒的病原菌有肠炎弧菌、沙门氏菌、弯曲杆菌、肠管出血性大肠杆菌、痢疾菌、霍乱菌等。

革兰氏染色的注意点

发生脱色过度等脱色不良时，有可能无法合理区分染色革兰氏阴性/革兰氏阳性，导致判断错误。另外，仅凭单一视野因信息不足，有可能难以判断。观察并分析多个视野后进行综合判断尤为重要。

借助荧光显微镜的微生物观察与定量分析

微生物在大多数情况下呈无色透明状态，因此通过以上介绍的微分干涉观察或相位差观察，对获取到的附带对比度的图像进行观察。另外，在根据细菌数量、染色性、形状或形态评价时，通过革兰氏染色实现可视化也𒉰是典型手法。但在使用ꦚ这些方法存在局限性，如果需要目视计算显微镜观察视野内的微生物（细菌）数量，或对拍摄画面内的多个微生物进行状态评价或形状确认会花费大量时间，因此难以完成定量分析。此外，微生物的实际生存时间，以及活死微生物比率的经时变化（Dead or Alive试验）等确认难度过高也是一大难题。

使用荧光显微镜解决微生物检查与微生物试验的难题

一般情况下，食品微生物检查及化妆品、医药部外品的微生物试验均以活细菌作为检查对象。荧光显微镜作为一种生物显微镜，将荧光抗体或荧光蛋白质作为标识，可在不损伤微生物或细菌细胞或蛋白质的情况下观察活细胞。
K8凯发的一体化荧光显微成像系统BZ-X800无需对微生物或细菌进行染色即可观察，在显著减少样品准备工时的同时，还可避免染色对微生物的损伤。对经过革兰氏染色的微生物或细菌也可轻松实现观察及定量分析、时序测量。尤其在必须依赖经时变化来获取多张不同图像并进行细菌计数等数据收集才能进行分析、评价时，可大幅削减工时。
另外，在化妆品或医药部外品的界面活性剂、防腐剂等评价中或食品乳酸菌数确认等中发挥重要作用的Dead or Alive（活死）试验中，通过使细胞膜发光来确认活微生物，并采用红色表示死微生物的亮度值变化即可辨识。可在活细胞成像（延时拍摄成像）中记录并呈现亮度值变化，或在随意时间进行观察或测量。
BZ-X800的这些功能不仅能够活用于食品微生物检查、化妆品及医药部外品微生物试验的定量分析、评价，还可利用视频浅显易懂地表现产品耐腐蚀性或抗菌性、食品所含乳酸菌或酵母等的作用，因此可用作对消费者更具号召力的促销工具。
而且，BZ-X800可利用内置ꦺ于🅺外壳内的暗室进行观察、分析，无需另行准备暗室。因此，作为内部检查导入时也不受安装位置的限制。