【原因1】光毒性对细胞造成了损伤

荧光观察时，激发光的波长越短或光照越强，对细胞造成的损伤也就越大。这就是所谓的“光毒性^*1”，不仅会导致细胞因受损而衰弱、死亡，还有可能会造成出乎意料的影响。

1. *1：光毒性：通常指照射的光造成的损伤，但是在荧光观察时，指细胞产生的活性氧使周围的细胞遭受损伤。
2. *2：增益：对相机接收的信号进行放大。放大程度越高（调高增益），显示的画面越明亮。虽然像素数不会变，但是会产生噪点。
3. *3：Binning：虚拟地结合周围的像素，放大单位像素接收的光信号的功能。噪点较调高增益时更少，但是像素数会减少。

【原因2】没有稳定供给合适的环境

多数细胞都喜欢与生物体内相同的环境。以人类细胞🐷为例，在培养室及培养用恒温箱中，基本上都需要满足温度37℃、二氧化碳浓度5%、湿度95%以上的条件。如果没有稳定供给这一条件，细胞就会衰弱，很难获得准确数据。

【原因3】菌、污染造成的影响

有的细胞容易受容器上附着的菌、污染物的影响。此外，移液管等实验用器械可能也会导致支原体污染^*4、交叉培养污染 ^*5。

【原因1】温度漂移^*7导致细胞移动，设定出错

如果在接通装置电源后马上进行拍摄设定，焦点在设定期间可能就会发生偏移。这是因为接通电源后的一段时间内，容器内的培养液会发生对流，细胞也会移动。观察设备等也会因温度变化而出现一定的膨胀现象，使焦点发生偏移。在观察漂浮细胞、粘附细胞﷽时，都需要注意拍摄设定中与拍摄中🐻的温度偏差。

【原因2】分裂时细胞运动

活着🅷的细胞在分裂时꧂尤其会朝上下方向（Z方向）运动。因此，如果在分裂的瞬间用高倍率进行单次自动对焦拍摄，焦点会发生偏移。

1. *8：景深：表示对焦的范围。一般NA越高景深越浅。
2. *9：Z栈的设定范围：Z栈是对不同的Z位置数据进行多张拍摄的功能。拍摄范围越大移动步径越小，可获得的信息越多，但是细胞的损伤也相应地增加，因此希望以尽可能少的张数进行设定。

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【原因】细胞动了

实验时间越长，细胞逃离视野🎃范围的可能性ཧ越高。只要细胞是活着的，就无法避免这一问题。相信大家都在各类论文中读到过观察细胞细节的数据。其中的绝大多数，都是通过高倍率反复进行多次拍摄后获得的结果，需要耗费大量的时间和精力。

要切实避免失败，较好的方法就是一次性拍摄多点，或者是让视野追随移动的细胞进行拍摄。

1. *10：曝光时间和图像抖动：调弱激发光，曝光时间自然变长。如果在打开快门期间细胞动了，图像就会抖动。要防止这种现象，使用高灵敏度的相机是一种有效的办法。

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