培养细胞转染效率的测量

什么是转染
转染的原理
提高转染效率的注意事项
转染效率的测量

什么是转染

转染（transfection）是通过向动物细胞内注入核酸的手法，将特定的基因注入细胞，以表达出目标蛋白质的过程。。通过转染摄取的核酸称为“外源核酸”，与经由病毒进行DNA转移的转导不同，基因无需经由病毒即可被靶细胞摄取。
摄取的核酸可🎃以暂时存在并表达，或在摄取的宿主基因组被复制的同时进行复制。其中，暂时存在核酸的转染称为“瞬时转染”，同时复制核酸的转染称为“稳定转染”。由此可以特异性地增强或抑制导入细胞中的基因表达，并进行重组蛋白的生成等。

转染的原理

镶嵌蛋白质的脂质双分子层构成的细胞膜带负电荷，阻碍DNA或RNA等带负电荷的较大的核酸（分子）通过。因此，为了实现转染，必须采用某种方法让核酸能够通过细胞♎膜。让核酸能够通过细胞膜的方法有化学手法、生物学手法和物理学手法，🧜其原理各不相同。下面以向细胞注入基因为例，介绍各自的手法、原理和优缺点。

化学手法

化学手法是使带负电荷的核酸带正电荷，或者中和其负电荷。具体有脂质体转染法和磷酸钙共沉淀法等，但脂质体转染法较为常用。
在脂质体转染法中，带正电荷的脂质体试剂的头基与带负电荷的核酸之间，通过静电相互作用构成阳离子脂质复合体。阳离子脂质复合体可以与带负电荷的细胞膜表面相互作用，有效地将核酸导入细胞内。这使得核酸可以通过内吞作用被细胞摄取并释放到细胞质中。脂质体转染法毒性低，操作性优异，是简单可行的转染手法。
并且，核酸可以有效地注入多种细胞系中，还能摄取蛋白质、DNA和RNA。此外，它还具有同时支持瞬时转染和稳定转染的优点。
不过，化学手法的缺点是，需要找寻适合细胞类型和培养的条件，因此导入效率低于物理学手法和生物学手法。

生物学手法

使用病毒的转染被称为生物学手法。病毒转染利用了病毒的感染能力，因此导入效率高，在难以摄取核酸的细胞中还被用作蛋白过表达的方法。它是临床研究中较为常用的手法，非常适合体内转染。体内的基因摄取使用腺病毒、逆转录病毒和慢病毒。
在这种转染中，首先会在复制基因的过程中生成重组病毒，吸收并增殖已导入具有辅助功能的基因的细胞，仅提取病毒载体。然后生成包含要植入的基因的病毒载体，将目标遗传物质递送给细胞。
虽然病毒转染用于动物实验等的生物ꦍ适应性高，但病毒难以制备，且需要适应生物安全等级。此外还有插入突变和因免疫而失活的缺点。

物理手法

物理手法是刺激细胞表面并穿透细胞膜，从而导入核酸。有电穿孔法、显微注射法及激光法等，其中电穿孔法较为常用。在电穿孔法中，首先将核酸和细胞悬浮在导电性溶液中，并夹在阳极和阴极之间，连续施加电脉冲，在细胞膜上形成小孔。然后，诸如DNA和RNA这种带电荷的细胞外核酸就通过该孔注入到细胞膜内。
物理手法具有导入效率高，并且比化学手法和生物学手法更容易的优点。但也存在细胞因电脉冲而死亡、♉电脉冲形成的孔不闭合等细胞毒性，且需✤要昂贵的特殊装置的缺点。

提高转染效率的注意事项

转染效率是指靶细胞摄取核酸的效率。下面介绍提高转染效率时的注意事项。

细胞存活率和传代培养: 转染前的细胞存活率优选为90％以上。并且，将细胞从培养系统转移到新鲜培养基的传代培养应在转染后24小时以内进行。但是，过多的传代可能会对转染效率产生不利影响，因此需要注意传代次数。
细胞培养和试剂: 转染非常适合的细胞占有面积率取决于试验的目的、方法、细胞类型等。如果细胞占有面积过高，将造成核酸摄取不足，或转基因表达减少。如果过低，将不会发生细胞间接触，增殖也不会进行。
进行转染时理想培养基取决于细胞或试剂、细胞适用的血清等。例如，将DNA导入干细胞时，使用可将核酸高效率低毒性导入ES细胞（Embryonic Stem cell：胚胎干细胞）、iPS细胞（induced Pluripotent Stem cells：诱导性多功能干细胞）、人类成体干细胞等的试剂。而将RNA导入干细胞时，使用可将siRNA（small interfering RNA）、mRNA（信使RNA）、dsRNA（double-stranded RNA）导入干细胞并保护它们免于降解的试剂。
转染法的选择: 转染有化学、生物学和物理等方法。化学方法和物理方法用于培养细胞的靶向转染。生物学方法是对培养细胞和动物个体行之有效的转染方法。然而，化学方法具有导入效率因细胞类型和状态而波动、受到化学毒性影响、难以选择性地导入特定细胞中等缺点。而物理方法的缺点是需要特殊的器具和装置、核酸容易被破坏。生物学方法则存在污染的危险性、将治疗用基因植入细胞染色体时发生的插入突变、免疫造成的失活等问题。
因此，注意待导入细胞与靶细胞的组合和缺点等，选择转染效率良好、再现性高的转染方法十分重要。
其他: 血清和抗生素的使用/不使用也会影响转染效率。例如，摄取DNA时，在含有血清的培养基中培养细胞会提高效率。在含有抗生素的培养基中进行瞬时转染也可以提高转染效率。
但是抗生素会引发细胞毒性，对细胞造成有害影响，因此可能会降低转染效率。另外，瞬时转染既可使用DNA载体也可使用RNA载体，稳定转染则只能使用DNA载体。

转染效率的测量

使用荧光显微镜是一种测量转染效率的常用手法。对观察到的细胞总数与荧光表达细胞ꦇ数ಞ进行计数及评分，据此测量转染效率。

转染效率的测量方法

为使🎉基因导入时细胞密度更加适合，将增殖培养基中制备的细胞悬浮液接种到孔培养板上，在恒温箱中进行培养。然后，将制备的复合体添加到细胞中，摇动孔培养板，再次在恒温箱中培养24小时。观察培养结束后细胞的表达活性，测量转染效率。测量转染效率一般通过可检测荧光色素的荧光显微镜进行观察。

转染效率测量的课题

在实际操作中，荧光显微镜存在各类问题，经常会让操作者耗费不少心力。
例如，要进行荧光观察，必须先将样本带进暗室，在暗室内进行试验，作业效率非常低。其次，由于难以正确提取细胞的轮廓，会对正确计数造成妨碍。
还﷽有许多人表示，要实现计数及分析，必须配备独立于荧光显ও微镜系统之外的其他软件，这为分析工作的顺利开展带来了不小的困难。

一体化荧光显微成像系统BZ-X800通过封闭样品区，形成内置暗室，因此即使是在明亮的室内也可进行荧光观察。亮度差异小的细胞相差图像，也能准确提取并量化细胞轮廓，可将细胞设为掩膜，测量各掩膜区域内的目标的个数和面积率等。无需另外准ꦍ备软件，即可实现定量细胞表达量，计算转染效率。